组织透明化应用丨《Theranostics》应用组织透明化技术对人淋巴瘤微环境进行3D成像和病理分析

1. 筛选了包括CD3、CD8、CD20、CD68、CD163、CD14、CD15、FOXP3和Ki67在内的多种抗体，用于标记淋巴瘤肿瘤中的TME。

2. 对三种类型的淋巴瘤（反应性淋巴细胞增生（RLN）、弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）和血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤（AITL））的TME进行了3D成像，并定量分析了它们的细胞数量、定位和空间相关性。

1. 选择适合人淋巴瘤组织的透明化方法

研究人员比较了四种不同的组织透明化技术：iDISCO+、uDISCO、CUBIC和SHIELD。最终选择了uDISCO方法，因为它在透明化速度、荧光信号保留以及与免疫标记抗体的兼容性方面表现最佳。

淋巴瘤TME三维成像分析流程概述

人体淋巴结标本四种组织透明化方法的性能比较

2. 淋巴瘤TME抗体panel设计及与uDISCO的兼容性测试

研究人员成功地为淋巴瘤TME的3D成像和分析选择了一组兼容的抗体，并验证了这些抗体在uDISCO透明化处理后能够保持有效的荧光标记。

不同淋巴免疫细胞的每种标记的LSFM图像

3. 多重免疫荧光标记的验证

研究人员进行了多重免疫荧光（mIF）标记的验证，以确保所使用的标记方法对于淋巴瘤肿瘤微环境（TME）的三维成像是有效的。

单细胞分辨率下淋巴瘤免疫TME的三维可视化

4. 人淋巴瘤组织TME的LSFM成像

研究人员首先将同一患者的淋巴瘤样本切割成四个块，每个块大约500微米厚。经过多重免疫荧光标记和透明化处理，使用自行开发的Bessel光束LSFM对透明化处理的样本进行高速、高分辨率的三维成像。将LSFM获取的图像数据导入Imaris软件，建立3D空间展示。从而提供淋巴瘤TME的3D全景图，并进行详细的细胞量化和空间相关性分析。

基于LSFM图像的数据处理流程分析淋巴瘤TMEs的空间相关性

5. 淋巴瘤TME内的免疫细胞共轭

通过淋巴瘤TME的3D可视化，使研究人员能够统计分析原位免疫细胞之间的空间相关性。

疫细胞之间的相互作用，尤其是T细胞与其他免疫细胞的共轭，可以影响患者的预后。如果不同细胞类型之间的距离小于15微米，则被认为是共轭的。研究人员还评估了B细胞和T细胞的增殖能力。

淋巴瘤TME中不同免疫细胞共定位的空间分析